TF Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401060-ACT

O gene humano F3 codifica o fator tecidual (TF), uma glicoproteína transmembrana que inicia a via extrínseca da coagulação ao se ligar ao fator VII/VIIa e promover, a jusante, a geração de trombina e a formação de fibrina. Além da hemostasia, o TF influencia a sinalização celular por meio de vias de receptores ativados por proteases (PAR) e pode modular a inflamação, a ativação endotelial e a integridade vascular. A expressão de F3 é regulada por programas responsivos a citocinas e ao estresse, conectando a atividade do TF ao crosstalk entre imunidade e coagulação e às respostas a lesão tecidual. Níveis e sinalização de TF desregulados têm sido associados a estados tromboinflamatórios e à atividade pró-coagulante associada a tumores, tornando F3 um alvo útil para estudos mecanísticos em biologia vascular e em vias relacionadas ao câncer.

TF O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de F3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TF O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus F3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição F3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TF. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus F3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TF no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TF em células tumorais com expressão de F3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.