TDO2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-425274-ACT

O gene Tdo2 de camundongo codifica a triptofano 2,3-dioxigenase (TDO2), uma enzima dependente de heme que catalisa a primeira etapa — e a etapa limitante da velocidade — do catabolismo do triptofano pela via da quinurenina. Ao controlar a conversão de L-triptofano em N-formilquinurenina, a TDO2 influencia a disponibilidade celular de triptofano, a produção de metabólitos a jusante relacionados ao NAD⁺ e a sinalização imunometabólica ligada ao receptor de hidrocarbonetos arílicos, mediada pela quinurenina. A atividade de Tdo2 está intimamente conectada à homeostase metabólica hepática e ao balanço sistêmico de aminoácidos, com efeitos subsequentes sobre respostas ao estresse oxidativo e programas inflamatórios. Um fluxo desregulado pela via da quinurenina tem sido associado à modulação imune e a fenótipos neuroinflamatórios, tornando Tdo2 um alvo relevante para estudos mecanísticos da interação entre metabolismo e imunidade em modelos murinos.

TDO2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Tdo2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TDO2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Tdo2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Tdo2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TDO2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Tdo2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TDO2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TDO2 em células tumorais com expressão de Tdo2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.