TDAG8 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-420643-ACT

O gene **Gpr65** de camundongo codifica o **TDAG8**, um receptor acoplado à proteína G sensível a prótons (GPCR) que detecta a acidose extracelular e transduz sinais por meio da produção de **cAMP** dependente de **Gαs** e de programas transcricionais a jusante. A atividade do TDAG8 influencia a ativação de células imunes, as respostas de citocinas e decisões de sobrevivência em microambientes ácidos, conectando a detecção de pH à sinalização inflamatória e à função dos leucócitos. Além das vias clássicas de segundos mensageiros de GPCR, o TDAG8 pode interagir com redes de resposta ao estresse que modulam a quimiotaxia e o remodelamento tecidual. A desregulação da sinalização **Gpr65/TDAG8** tem sido associada a mecanismos de doenças imunomediadas e a interações tumor–imunidade nas quais a acidose é uma pista contextual fundamental, sustentando seu uso em estudos mecanísticos de inflamação e de detecção do microambiente.

TDAG8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Gpr65 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TDAG8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Gpr65 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Gpr65, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TDAG8. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Gpr65 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TDAG8 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TDAG8 em células tumorais com expressão de Gpr65 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.