TCP-1 δ Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403515-ACT

CCT4 codifica a subunidade delta do TCP-1 (CCTδ) do complexo citosólico de chaperonina contendo TCP1 (TRiC/CCT), uma máquina central de dobramento dependente de ATP para actina, tubulina e diversas proteínas cliente necessárias para a proteostase. Por meio da regulação da montagem do citoesqueleto, da progressão do ciclo celular e do controle de qualidade de polipeptídeos recém-sintetizados, a CCTδ sustenta processos como a função do fuso mitótico, o tráfego intracelular e a homeostase proteica responsiva ao estresse. A atividade do TRiC/CCT é frequentemente estudada no contexto da sinalização oncogênica, do estresse proteotóxico e da neurodegeneração, em que alterações na capacidade da chaperonina podem remodelar as paisagens de dobramento proteico e o output de vias. Como um componente central do chaperoma, CCT4 oferece um ponto de entrada mecanístico para investigar a regulação dependente de dobramento de redes de sinalização e da dinâmica do citoesqueleto em células humanas.

TCP-1 δ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CCT4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TCP-1 δ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CCT4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CCT4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TCP-1 δ. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CCT4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TCP-1 δ no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TCP-1 δ em células tumorais com expressão de CCT4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.