TBC1D20 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-426458-ACT

Tbc1d20 codifica a TBC1D20, uma proteína ativadora de GTPase (GAP) para Rab que regula o tráfego de membranas dependente de Rab e mantém a organização do retículo endoplasmático (RE). Ao acelerar a hidrólise de GTP em proteínas Rab específicas, a TBC1D20 influencia a formação de vesículas, a triagem de carga e a dinâmica RE–Golgi que molda a homeostase da via secretória. A disrupção desses processos pode perturbar o metabolismo lipídico e a morfologia de organelas, vinculando redes de tráfego reguladas por TBC1D20 a respostas celulares ao estresse. Em modelos murinos, o estudo da função de Tbc1d20 dá suporte à dissecação mecanística de vias de transporte intracelular relevantes para fenótipos do neurodesenvolvimento e do metabolismo.

TBC1D20 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Tbc1d20 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TBC1D20 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Tbc1d20 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Tbc1d20, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TBC1D20. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Tbc1d20 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TBC1D20 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TBC1D20 em células tumorais com expressão de Tbc1d20 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.