TASK-3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403974-ACT

O KCNK9 humano codifica o TASK-3 (K2P9.1), um canal de potássio de dois poros que contribui para a condutância basal (“leak”) de K+ e ajuda a estabelecer o potencial de membrana em repouso e a excitabilidade da membrana. O TASK-3 é sensível ao pH extracelular e modula as propriedades de disparo em tecidos excitáveis, ligando a homeostase iónica a programas de sinalização celular, como vias dependentes de cálcio e a transcrição regulada pela atividade. Pelo seu impacto na polarização da membrana, o TASK-3 influencia processos que incluem a secreção neuronal e endócrina, a progressão do ciclo celular e a adaptação ao stress metabólico ou hipóxico. Alterações na expressão ou função de KCNK9/TASK-3 têm sido associadas a fenótipos do neurodesenvolvimento e têm sido estudadas no contexto da biologia do cancro, onde a sinalização bioelétrica dependente de canais de potássio pode afetar a proliferação e a sobrevivência.

TASK-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de KCNK9 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TASK-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus KCNK9 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição KCNK9, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TASK-3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus KCNK9 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TASK-3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TASK-3 em células tumorais com expressão de KCNK9 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.