Synaptotagmin I Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-423243-ACT

Syt1 codifica a Sinaptotagmina I, uma proteína de membrana de vesículas sinápticas que atua como sensor de Ca²⁺, acoplando o influxo de cálcio à liberação rápida e síncrona de neurotransmissores. Por meio da ligação dependente de Ca²⁺ a fosfolipídios e de interações com a maquinaria SNARE, a Sinaptotagmina I regula o acoplamento (docking), o preparo (priming) e a fusão de membranas das vesículas durante a transmissão sináptica. Syt1 é central para a excitabilidade neuronal e para a sinalização dependente de atividade, e a perturbação de sua expressão ou função é amplamente utilizada para modelar defeitos na cinética de liberação sináptica e na plasticidade de circuitos. Em sistemas murinos, a biologia de Syt1 é frequentemente estudada no contexto de pesquisas sobre neurodesenvolvimento e neurodegeneração, nas quais alterações na liberação pré-sináptica podem remodelar o comportamento das redes neurais.

Synaptotagmin I O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Syt1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Synaptotagmin I O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Syt1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Syt1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Synaptotagmin I. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Syt1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Synaptotagmin I no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Synaptotagmin I em células tumorais com expressão de Syt1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.