SV2A Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-425665-ACT

O gene Sv2a de camundongo codifica a glicoproteína 2A de vesículas sinápticas (SV2A), um componente integral de membrana das vesículas presinápticas que regula o preparo (priming) das vesículas e a probabilidade de liberação de neurotransmissores. A SV2A participa da transmissão sináptica dependente de atividade ao influenciar o ciclo das vesículas e a exocitose acoplada ao cálcio, sustentando um tráfego e uma reciclagem eficientes das vesículas sinápticas. Alterações na expressão ou na função de SV2A estão associadas a perturbações na excitabilidade de redes neuronais e têm sido usadas como um indicador molecular em estudos de epilepsia, fenótipos do neurodesenvolvimento e disfunção sináptica mais ampla relevante para mecanismos de doenças neurológicas.

SV2A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Sv2a sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SV2A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Sv2a em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Sv2a, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SV2A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Sv2a nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SV2A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SV2A em células tumorais com expressão de Sv2a silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.