Stomatin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402491-ACT

O STOM humano codifica a estomatina, uma proteína integral de membrana enriquecida em balsas lipídicas (lipid rafts) que modula a organização da membrana e a atividade de canais iônicos, incluindo a regulação de complexos mecanossensíveis e do canal epitelial de sódio (ENaC). A estomatina contribui para o acoplamento ao citoesqueleto, o tráfego vesicular e a sinalização dependente de microdomínios de membrana, que influenciam o controle do volume celular e as respostas ao estresse. Alterações na expressão de STOM ou na sua localização na membrana têm sido associadas a defeitos da membrana de hemácias, como a estomatocitose hereditária, e podem afetar a biomecânica celular e a homeostase iônica. Como uma plataforma (scaffold) associada a rafts, a estomatina é frequentemente estudada em vias que conectam a detecção de tensão de membrana, o transporte de íons e a adaptação ao estresse inflamatório ou metabólico.

Stomatin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de STOM sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Stomatin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus STOM em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição STOM, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Stomatin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus STOM nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Stomatin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Stomatin em células tumorais com expressão de STOM silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.