SRp40 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401886-ACT

O SRSF5 humano codifica o fator de splicing SRp40, uma proteína ligadora de RNA rica em serina/arginina que regula o splicing constitutivo e alternativo de pré-mRNA e influencia a definição de exões por meio de interações com potenciadores exônicos de splicing. O SRp40 contribui para redes de processamento de RNA que acoplam o splicing à transcrição e à exportação de mRNA, moldando a escolha de isoformas em vias que controlam a progressão do ciclo celular, a apoptose e respostas ao estresse. Alterações na atividade ou na expressão de SRSF5 podem deslocar o equilíbrio de isoformas geradas por splicing e têm sido associadas à desregulação do metabolismo de RNA observada em diversos contextos de doença, incluindo sinalização relacionada ao câncer e fenótipos proliferativos. Como um nó na regulação do spliceossomo mediada por proteínas SR, o SRp40 é frequentemente estudado pelo seu impacto na remodelação do transcriptoma e na diversidade do proteoma.

SRp40 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SRSF5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SRp40 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SRSF5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SRSF5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SRp40. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SRSF5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SRp40 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SRp40 em células tumorais com expressão de SRSF5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.