SR-2B Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402574-ACT

O HTR2B humano codifica o receptor de serotonina 2B (SR-2B), um receptor acoplado à proteína G (GPCR) que se acopla principalmente a Gq/11 para estimular a sinalização da fosfolipase C, o turnover de fosfatos de inositol, a mobilização intracelular de Ca2+ e a atividade da via MAPK/ERK dependente de PKC. O SR-2B modula programas transcricionais ligados ao crescimento celular, à remodelação da matriz extracelular e à dinâmica do citoesqueleto, integrando sinais serotoninérgicos com redes de sinalização específicas de cada tecido. Alterações de expressão e de sinalização em HTR2B têm sido associadas à remodelação cardiovascular e à biologia valvar, e atividade alterada do receptor foi relatada em contextos neuropsiquiátricos e fibróticos, sustentando estudos mecanísticos da fisiopatologia impulsionada pela serotonina. Essas características tornam o SR-2B um alvo útil para investigar a transdução de sinal de GPCRs, a sinalização enviesada do receptor e respostas regulatórias de genes a jusante em modelos de células humanas.

SR-2B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HTR2B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SR-2B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HTR2B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HTR2B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SR-2B. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HTR2B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SR-2B no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SR-2B em células tumorais com expressão de HTR2B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.