Plasmide CRISPR d'Activation (h) spectrin β I: sc-402738-ACT

SPTB code la spectrine βI, un composant essentiel du squelette membranaire des érythrocytes, qui forme des hétérotétramères avec la spectrine α afin d’assurer la stabilité, l’élasticité et la forme biconcave de la membrane plasmique. En se couplant aux complexes d’actine et d’ankyrine, la spectrine βI contribue à organiser des microdomaines membranaires et à coordonner la résistance mécanique lors des déformations répétées dans la microcirculation. Une altération de l’architecture cytosquelettique dépendante de SPTB perturbe l’intégrité des globules rouges, favorisant des changements morphologiques et une fragilité accrue. Les variations génétiques de SPTB sont associées à des anémies hémolytiques héréditaires, notamment la sphérocytose héréditaire et d’autres affections apparentées de la membrane érythrocytaire, ce qui en fait une cible pertinente pour étudier la mécanique du cytosquelette et l’homéostasie membranaire.

spectrin β I Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SPTB sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

spectrin β I Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SPTB dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SPTB, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de spectrin β I. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SPTB natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de spectrin β I au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie spectrin β I dans les cellules tumorales présentant une expression de SPTB silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.