SPAG4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404154-ACT

SPAG4 (antígeno 4 associado a espermatozoides), também conhecido como SUN4, é uma proteína do envelope nuclear enriquecida nos testículos, implicada no acoplamento mediado pelo complexo LINC entre o núcleo e o citoesqueleto. Em células germinativas, o SPAG4 contribui para a modelagem do núcleo das espermátides e para a organização do citoesqueleto durante a espermiogênese, refletindo funções no posicionamento nuclear e na mecanotransdução na periferia nuclear. A disrupção ou a alteração da expressão de SPAG4 tem sido associada a fenótipos de fertilidade masculina e também é descrita como expressa de forma aberrante em múltiplos contextos tumorais, nos quais é investigada como um antígeno câncer-testículo. Essas propriedades tornam o SPAG4 um modelo útil para estudar a dinâmica do envelope nuclear, programas de diferenciação da linhagem germinativa e a expressão antigênica desregulada em estados celulares relevantes para doenças.

SPAG4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SPAG4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SPAG4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SPAG4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SPAG4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SPAG4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SPAG4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SPAG4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SPAG4 em células tumorais com expressão de SPAG4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.