SP-D Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401572-ACT

O SFTPD humano codifica a proteína D do surfactante (SP-D), uma lectina do tipo C contendo colagénio (collectina) secretada principalmente por células alveolares do tipo II e pelo epitélio das vias aéreas, que se liga a glicanos associados a patógenos e a dano para promover a opsonização e a aglutinação. A SP-D modula a sinalização imunitária inata ao influenciar processos relacionados com o complemento e ao regular o tónus inflamatório no pulmão, incluindo efeitos na ativação de macrófagos e na produção de citocinas. Por meio dessas atividades, contribui para a homeostase do surfactante e para a defesa mucosa na interface ar–líquido. Alterações na expressão de SFTPD ou na função da SP-D têm sido associadas a inflamação pulmonar desregulada e a maior suscetibilidade a fenótipos de doença respiratória, tornando-o um alvo útil para estudos mecanísticos em modelos de vias aéreas e alveolares.

SP-D O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SFTPD sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SP-D O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SFTPD em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SFTPD, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SP-D. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SFTPD nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SP-D no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SP-D em células tumorais com expressão de SFTPD silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.