SMG8 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-408902-ACT

SMG8 codifica um componente central do complexo SMG1C que regula a degradação de mRNA mediada por nonsense (NMD), uma via conservada de vigilância de RNA que detecta e degrada transcritos contendo códons de terminação prematuros. Ao modular a atividade quinase de SMG1 e coordenar a dinâmica de fosforilação de UPF1, SMG8 ajuda a acoplar a terminação da tradução à remodelação de mRNPs e à degradação direcionada de mRNA. Por meio desses mecanismos, SMG8 contribui para o controle de qualidade do transcriptoma, a proteostase e programas de expressão gênica responsivos ao estresse. A NMD desregulada e perturbações na metabolização de RNA associadas a SMG8 têm sido relacionadas a alterações na homeostase celular e são estudadas em contextos que incluem fenótipos do neurodesenvolvimento e mudanças na expressão gênica relevantes para o câncer.

SMG8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SMG8 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SMG8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SMG8 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SMG8, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SMG8. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SMG8 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SMG8 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SMG8 em células tumorais com expressão de SMG8 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.