Smad6 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-421529-ACT

Smad6 codifica uma proteína SMAD inibitória que atua como regulador de retroalimentação negativa da sinalização de BMP e, em alguns contextos, de TGF-β, ao interferir na ativação de SMADs regulados por receptor e nos programas transcricionais a jusante. Em células de camundongo, a SMAD6 ajuda a ajustar processos impulsionados por BMP, como a diferenciação osteogênica, a homeostase vascular e a padronização do desenvolvimento, ao restringir a intensidade e a duração do sinal. Ao modular a expressão gênica canônica dependente de SMAD, a SMAD6 influencia decisões de destino celular, proliferação e remodelação da matriz extracelular. A atividade desregulada de SMAD6 tem sido associada na literatura a alterações na saída da via de BMP ligadas a fenótipos congênitos e cardiovasculares e a anormalidades do desenvolvimento esquelético, tornando-a um nó útil para estudos mecanísticos de vias de sinalização.

Smad6 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Smad6 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Smad6 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Smad6 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Smad6, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Smad6. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Smad6 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Smad6 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Smad6 em células tumorais com expressão de Smad6 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.