SKI-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402595-ACT

MBTPS1 codifica a SKI-1/S1P, uma convertase de pró-proteínas do tipo subtilisina, residente no Golgi, que cliva fatores de transcrição ancorados à membrana para controlar sua ativação e translocação nuclear. A SKI-1 é um regulador upstream essencial da homeostase de esteróis e lipídios por meio do processamento de SREBPs, influenciando assim programas biossintéticos de colesterol e ácidos graxos e redes mais amplas de sinalização metabólica. Ela também participa de vias adaptativas ao estresse ER–Golgi ao modular a ativação de ATF6 e respostas correlatas de proteostase. A desregulação da atividade de MBTPS1/SKI-1 tem sido associada a fenótipos hereditários do tecido conjuntivo e do esqueleto e a estados celulares caracterizados por metabolismo lipídico alterado, tornando-a relevante para estudos mecanísticos em metabolismo, biologia da via secretória e sinalização de estresse.

SKI-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MBTPS1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SKI-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MBTPS1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MBTPS1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SKI-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MBTPS1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SKI-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SKI-1 em células tumorais com expressão de MBTPS1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.