SID-2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-407959-ACT

O SIDT2 humano (SID-2) codifica uma proteína de membrana endolisossomal implicada no transporte intracelular de ácidos nucleicos e em processos homeostáticos associados aos lisossomos. Funções descritas relacionam o SID-2 ao tráfego endocítico, à integridade lisossomal e a redes mais amplas de proteostase que influenciam a degradação de macromoléculas e as respostas ao estresse. Por meio dessas vias, o SIDT2 tem sido investigado em contextos nos quais a disfunção lisossomal contribui para fenótipos celulares, incluindo modelos relevantes para doenças neurodegenerativas e metabólicas. A modulação da expressão de SIDT2 dá suporte a estudos mecanísticos sobre transporte endolisossomal, processamento de RNA e sinalização dependente de lisossomos.

SID-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SIDT2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SID-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SIDT2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SIDT2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SID-2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SIDT2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SID-2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SID-2 em células tumorais com expressão de SIDT2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.