SIAH-2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401503-ACT

SIAH2 codifica a SIAH-2, uma ligase E3 de ubiquitina do tipo RING que regula o turnover proteico ao direcionar substratos específicos para ubiquitinação e degradação pelo proteassoma. A SIAH-2 integra sinais de hipóxia e respostas ao estresse celular e modula vias ligadas à sinalização de HIF, à atividade de MAPK e ao controle do ciclo celular, influenciando assim programas transcricionais, metabolismo e sobrevivência. Por meio do controle dependente de ubiquitina de intermediários dessas vias, a SIAH-2 pode remodelar redes de adesão e motilidade e contribuir para a remodelação do microambiente tumoral. A desregulação da expressão ou da atividade de SIAH2 tem sido associada a alterações na adaptação à hipóxia e na proteostase em contextos relevantes para a biologia do câncer e outros distúrbios relacionados ao estresse.

SIAH-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SIAH2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SIAH-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SIAH2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SIAH2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SIAH-2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SIAH2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SIAH-2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SIAH-2 em células tumorais com expressão de SIAH2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.