Shh Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400225-ACT

O SHH humano codifica o Sonic hedgehog (Shh), um morfógeno secretado que coordena a padronização embrionária, a polaridade tecidual e o comportamento de células‑tronco/progenitoras por meio da cascata de sinalização Hedgehog. O Shh liga-se ao PTCH1 para aliviar a repressão de SMO, permitindo a ativação dos fatores de transcrição GLI e de programas a jusante que regulam proliferação, diferenciação e organização espacial. Em tecidos adultos, o SHH contribui para interações epitélio–mesênquima e para a manutenção de nichos, e a sinalização Hedgehog desregulada está implicada em distúrbios do desenvolvimento e em contextos de sinalização oncogênica. A atividade da via SHH é comumente estudada por seus papéis no desenvolvimento do tubo neural e dos membros, na organogênese e no controle transcricional dependente de sinais.

Shh O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SHH sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Shh O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SHH em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SHH, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Shh. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SHH nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Shh no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Shh em células tumorais com expressão de SHH silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.