SETD2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-433485-ACT

Setd2 codifica a metiltransferase de histonas SETD2 de camundongo, a principal enzima responsável pela trimetilação da lisina 36 da histona H3 (H3K36me3) ao longo dos corpos de genes transcritos ativamente. Essa marca de cromatina coordena o alongamento transcricional, o processamento de RNA co-transcricional, a fidelidade da replicação do DNA e o reparo de danos ao DNA ligado à recombinação homóloga, ajudando a manter a estabilidade do genoma. A SETD2 também metila substratos não histônicos, como a α-tubulina, associando-a à organização do citoesqueleto e à regulação mitótica. A desregulação do controle epigenético dependente de SETD2 é amplamente relevante para estudos de transformação oncogênica, estresse replicativo e uso aberrante de vias de reparo de DNA em células de mamíferos.

SETD2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Setd2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SETD2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Setd2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Setd2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SETD2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Setd2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SETD2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SETD2 em células tumorais com expressão de Setd2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.