secretin receptor Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-435601-ACT

Il gene murino **Sctr** codifica il recettore della secretina, un GPCR di classe B che lega la secretina per regolare la secrezione di fluidi ricchi di bicarbonato e il trasporto epiteliale nel tratto gastrointestinale e nel pancreas. L’attivazione del recettore coinvolge principalmente la via di segnalazione **Gs–adenilil ciclasi**, aumentando il **cAMP** e attivando programmi trascrizionali e metabolici dipendenti da **PKA**, con un ulteriore accoppiamento che in alcuni tipi cellulari può influenzare la segnalazione del calcio. L’attività di Sctr contribuisce alla comunicazione neuroendocrina e asse intestino–cervello, plasmando la fisiologia digestiva e l’omeostasi energetica. La deregolazione della segnalazione del recettore della secretina è stata studiata in modelli di disfunzione esocrina pancreatica, disturbi colestatici e gastrointestinali e fenotipi neurocomportamentali, rendendo Sctr un nodo utile per l’analisi delle vie di segnalazione in vivo e in cellule in coltura.

secretin receptor Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Sctr senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

secretin receptor Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Sctr nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Sctr, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di secretin receptor. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Sctr nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da secretin receptor nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via secretin receptor nelle cellule tumorali con espressione di Sctr silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.