Sec61β Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402791-ACT

SEC61B codifica a Sec61β, uma pequena subunidade do translocon heterotrimérico Sec61, embebido na membrana do retículo endoplasmático (RE), que dá suporte à importação co-traducional de proteínas e à integração de proteínas de membrana. Ao acoplar o ancoramento do ribossomo ao RE e ao coordenar-se com a via da partícula de reconhecimento de sinal (SRP), a Sec61β contribui para a proteostase secretória e para processos de controlo de qualidade do RE ligados à resposta a proteínas mal dobradas e à degradação associada ao RE (ERAD). Perturbações no tráfego dependente do translocon podem influenciar a maturação de recetores, canais e fatores secretados, tornando o SEC61B relevante para estudos de stress do RE, desequilíbrio do proteoma e mecanismos mais amplos que moldam a homeostase celular. Como o complexo Sec61 também afeta a apresentação de antigénios e a biogénese de reguladores imunitários e metabólicos, o SEC61B é frequentemente analisado em rastreios de genómica funcional que investigam a adaptação ao stress e fenótipos de processamento de proteínas.

Sec61β O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SEC61B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Sec61β O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SEC61B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SEC61B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Sec61β. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SEC61B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Sec61β no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Sec61β em células tumorais com expressão de SEC61B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.