SDHA Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401689-ACT

SDHA codifica a subunidade A flavoproteica do complexo succinato desidrogenase, um componente catalítico central do complexo II mitocondrial que conecta o ciclo do ácido tricarboxílico à cadeia de transporte de elétrons ao oxidar succinato em fumarato e transferir elétrons para a ubiquinona. Por meio do seu papel na fosforilação oxidativa e na homeostase redox, a SDHA influencia a produção celular de ATP, o metabolismo mitocondrial e o equilíbrio de espécies reativas de oxigênio. Alterações na função de SDHA podem desorganizar o fluxo bioenergético e a sinalização metabólica, com efeitos posteriores sobre a resposta à hipóxia e vias de estresse mitocondrial. Perturbações genéticas e funcionais de SDHA têm sido associadas a fenótipos de doenças mitocondriais e à biologia de tumores com deficiência de SDH, sustentando sua utilidade como alvo-modelo em pesquisa metabólica e em câncer.

SDHA O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SDHA sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SDHA O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SDHA em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SDHA, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SDHA. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SDHA nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SDHA no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SDHA em células tumorais com expressão de SDHA silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.