Plásmido CRISPR de Activación (m) SCUBE2: sc-425305-ACT

Scube2 codifica SCUBE2, una glicoproteína secretada asociada a la superficie celular que contiene repeticiones tipo EGF y un dominio CUB, y que funciona como andamiaje extracelular y modulador de señales. En tejidos de ratón, SCUBE2 contribuye al patrón del desarrollo y a la comunicación intercelular al influir en la disponibilidad de factores de crecimiento y en la dinámica de señalización de los receptores, con conexiones descritas con vías como la señalización Hedgehog. Al modelar las interacciones ligando–receptor y los procesos asociados a la matriz extracelular, SCUBE2 puede afectar decisiones de destino celular, migración y organización epitelial. La expresión alterada de SCUBE2 se ha asociado con programas de señalización desregulados relevantes para la biología del cáncer y anomalías del desarrollo, lo que respalda su uso como un nodo mecanístico en estudios centrados en vías.

SCUBE2 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Scube2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

SCUBE2 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Scube2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Scube2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de SCUBE2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Scube2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de SCUBE2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía SCUBE2 en células tumorales con expresión de Scube2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.