SCUBE2 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-425305-ACT

Scube2 codifica SCUBE2, una glicoproteina secreta associata alla superficie cellulare che contiene ripetizioni simili a EGF e un dominio CUB, e che funziona come impalcatura extracellulare e modulatore della segnalazione. Nei tessuti murini, SCUBE2 contribuisce alla definizione dei pattern di sviluppo e alla comunicazione intercellulare influenzando la disponibilità dei fattori di crescita e la dinamica della segnalazione recettoriale, con collegamenti riportati a vie quali la segnalazione Hedgehog. Modellando le interazioni ligando–recettore e i processi associati alla matrice extracellulare, SCUBE2 può influenzare le decisioni di destino cellulare, la migrazione e l’organizzazione epiteliale. Un’espressione alterata di SCUBE2 è stata associata a programmi di segnalazione deregolati rilevanti per la biologia del cancro e per anomalie dello sviluppo, a supporto del suo impiego come nodo meccanicistico in studi incentrati sulle vie di segnalazione.

SCUBE2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Scube2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SCUBE2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Scube2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Scube2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SCUBE2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Scube2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SCUBE2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SCUBE2 nelle cellule tumorali con espressione di Scube2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.