SCG10 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422814-ACT

Stmn2 codifica SCG10, una fosfoproteina della famiglia delle statmine arricchita nei neuroni che regola la dinamica dei microtubuli legando la tubulina e promuovendo la destabilizzazione dei microtubuli durante l’inizio della formazione dei neuriti, la crescita dell’assone e il rimodellamento del cono di crescita nelle cellule di topo. SCG10 viene trasportata verso neuriti e coni di crescita, collegando il rimodellamento del citoscheletro al traffico intracellulare e alla plasticità neuronale dipendente dall’attività. Attraverso il controllo del turnover dei microtubuli, SCG10 influenza processi quali la rigenerazione assonale, la connettività sinaptica e i programmi di differenziamento neuronale. Un’alterata regolazione di STMN2/SCG10 è spesso studiata nel contesto della neurodegenerazione e delle assonopatie, incluse vie implicate nella vulnerabilità dei motoneuroni e nel mantenimento assonale compromesso.

SCG10 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Stmn2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SCG10 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Stmn2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Stmn2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SCG10. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Stmn2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SCG10 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SCG10 nelle cellule tumorali con espressione di Stmn2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.