SCG10 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404807-ACT

STMN2 (SCG10) codifica un membro della famiglia delle statmine arricchito nei neuroni e regolato durante lo sviluppo, che si lega agli eterodimeri di tubulina e modula la dinamica dei microtubuli. Promuovendo la depolimerizzazione dei microtubuli e regolando il comportamento dell’estremità “plus”, SCG10 sostiene l’estensione dei neuriti, la guida assonale, il rimodellamento del cono di crescita e la plasticità sinaptica. L’espressione e il turnover di STMN2 si intrecciano con programmi di traffico del citoscheletro e vie di risposta allo stress che modellano la connettività neuronale. Una disregolazione di STMN2 è stata associata a fenotipi neurodegenerativi e neurosviluppo, in cui una compromessa manutenzione assonale e difetti nell’elaborazione dell’RNA contribuiscono alla vulnerabilità neuronale.

SCG10 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di STMN2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SCG10 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus STMN2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione STMN2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SCG10. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus STMN2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SCG10 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SCG10 nelle cellule tumorali con espressione di STMN2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.