SCG10 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404807-ACT

STMN2 (SCG10) codifica um membro da família das estatminas, enriquecido em neurônios e regulado durante o desenvolvimento, que se liga a heterodímeros de tubulina e modula a dinâmica dos microtúbulos. Ao promover a despolimerização dos microtúbulos e regular o comportamento da extremidade “plus”, a SCG10 sustenta o crescimento de neuritos, a orientação axonal, a remodelação do cone de crescimento e a plasticidade sináptica. A expressão e a renovação (turnover) de STMN2 intersectam programas de tráfego do citoesqueleto e vias de resposta ao estresse que moldam a conectividade neuronal. A desregulação de STMN2 tem sido associada a fenótipos neurodegenerativos e do neurodesenvolvimento, nos quais a manutenção axonal prejudicada e defeitos no processamento de RNA contribuem para a vulnerabilidade neuronal.

SCG10 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de STMN2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SCG10 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus STMN2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição STMN2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SCG10. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus STMN2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SCG10 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SCG10 em células tumorais com expressão de STMN2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.