Sar1B CRISPR Activation Plasmid (m): sc-425994-ACT

Sar1b kodiert die kleine GTPase SAR1B, einen zentralen Regulator der Bildung COPII-beschichteter Vesikel an ER-Austrittsstellen. Durch den Wechsel zwischen GDP- und GTP-gebundenen Zuständen initiiert SAR1B Membrankrümmung und rekrutiert COPII-Komponenten, um den ER-zu-Golgi-Transport sekretorischer und membranständiger Proteine zu steuern, einschließlich lipoproteinassoziierter Fracht. Der Sar1b-abhängige Transport ist mit der Proteostase im ER, dem Lipidstoffwechsel und der Antwort auf fehlgefaltete Proteine (Unfolded Protein Response, UPR) verknüpft und ist damit relevant für Studien zur intestinalen Lipidresorption, zur Sekretion von Hepatozyten und zur metabolischen Homöostase. Eine Störung der SAR1B-Funktion wird mit Defekten im Export von Chylomikronen und in der systemischen Lipidverteilung in Verbindung gebracht, was Sar1b als mechanistischen Knotenpunkt in Modellen der Dyslipidämie und des Organellenstresses unterstützt.

Sar1B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Sar1b-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Sar1B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Sar1b-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Sar1b-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Sar1B-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Sar1b-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Sar1B-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Sar1B-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Sar1b-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.