Sam 68 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401378-ACT

KHDRBS1 codifica Sam 68 (Src-associated in mitosis 68 kDa), una proteina legante l’RNA della famiglia STAR che collega la trasduzione del segnale al metabolismo dell’RNA. Sam 68 regola lo splicing alternativo, l’esportazione dell’mRNA, la stabilità e la traduzione legandosi a elementi ricchi in U/A, ed è controllata dinamicamente dalla fosforilazione e da altre modifiche post-traduzionali. Partecipa a vie legate alla progressione del ciclo cellulare, alle risposte al danno al DNA e al rimodellamento del citoscheletro, integrando segnali provenienti dalle chinasi della famiglia Src e dalla segnalazione MAPK. Un’attività deregolata di Sam 68 è stata associata a programmi di splicing alterati e a pattern aberranti di espressione genica osservati in diversi modelli rilevanti per il cancro e la neurodegenerazione, a supporto del suo impiego come nodo meccanicistico nella ricerca sul processamento dell’RNA.

Sam 68 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KHDRBS1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Sam 68 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KHDRBS1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KHDRBS1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Sam 68. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KHDRBS1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Sam 68 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Sam 68 nelle cellule tumorali con espressione di KHDRBS1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.