RyR Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401470-ACT

O RYR1 humano codifica o receptor de rianodina (RyR1), um canal tetramérico de liberação de Ca²⁺ do retículo sarcoplasmático/endoplasmático que acopla a despolarização da membrana à rápida mobilização intracelular de cálcio. Transientes de Ca²⁺ mediados por RyR1 regulam o acoplamento excitação–contração, a liberação de cálcio induzida por cálcio e vias de sinalização a jusante que moldam o metabolismo mitocondrial, a dinâmica do citoesqueleto e as respostas transcricionais ao cálcio. A atividade de RYR1 é rigidamente controlada pelo Ca²⁺ luminal, pelo estado redox e por proteínas acessórias como FKBP12, calmodulina e complexos triadina/junctina. A desregulação da abertura/fechamento do canal RyR1 e a homeostase aberrante de Ca²⁺ estão associadas à fisiopatologia do músculo esquelético e são frequentemente estudadas no contexto da suscetibilidade à hipertermia maligna e de miopatias congênitas.

RyR-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RYR1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RyR-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RYR1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RYR1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RyR-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RYR1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RyR-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RyR-1 em células tumorais com expressão de RYR1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.