RyR Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402986-ACT

O RYR2 humano codifica o receptor de rianodina 2 (RyR2), um grande canal de liberação de Ca²⁺ do retículo sarcoplasmático/endoplasmático que coordena o acoplamento excitação–contração ao modular os transientes de cálcio citosólico. A atividade do RyR2 integra sinais das vias de cAMP/PKA e CaMKII e se conecta à liberação de cálcio induzida por cálcio, ao metabolismo mitocondrial e a programas transcricionais a jusante. Alterações na expressão do RYR2 ou na regulação do canal desorganizam a homeostase de Ca²⁺, promovendo ondas de cálcio aberrantes e sinalização eletrofisiológica alterada em cardiomiócitos. A disfunção do RYR2 está associada a fenótipos de ritmo cardíaco hereditários e adquiridos, tornando-o um nó central para estudos mecanísticos do manejo de cálcio e de respostas ao estresse celular.

RyR-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RYR2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RyR-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RYR2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RYR2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RyR-2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RYR2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RyR-2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RyR-2 em células tumorais com expressão de RYR2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.