Rubicon CRISPR Activationプラスミド (m): sc-432438-ACT

マウス1700021K19RikはRubicon（RUNドメインおよびシステインリッチドメインを有し、Beclin 1結合性タンパク質）をコードしており、オートファジーとエンドリソソーム成熟を調節することで膜輸送を制御する因子です。Rubiconは、Beclin 1–VPS34クラスIII PI3K複合体との相互作用を介してオートファゴソーム—リソソーム融合を抑制すること、またLC3関連貪食に影響を与えることが特によく知られており、その結果としてリソソーム分解、炎症、細胞ストレス応答の在り方を規定します。オートファジーおよび貪食経路におけるフラックスを制御することで、Rubiconはミトコンドリアの品質管理、抗菌防御、サイトカイン産生プログラムにも影響し、神経変性、代謝異常、免疫介在性病態と関連する過程に関与し得ます。これらの機能により、Rubiconは、多様なマウス細胞種において小胞輸送とリソソーム依存的なターンオーバーが恒常性をどのように制御するかを解明するための有用な結節点となります。

Rubicon CRISPR活性化プラスミド（m）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性1700021K19Rikの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

Rubicon CRISPR 活性化プラスミド (m) は、ヒト細胞株における 1700021K19Rik 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体は1700021K19Rik転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性Rubiconの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然の1700021K19Rik遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるRubicon依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、および1700021K19Rik発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるRubicon経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。