RPGRIP1L Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404458-ACT

RPGRIP1L codifica una proteina della zona di transizione ciliare che funge da piattaforma per componenti interagenti con RPGR e contribuisce a stabilire la barriera di diffusione che controlla il traffico proteico in entrata e in uscita dal ciglio primario. Partecipa all’organizzazione del centrosoma/corpo basale e sostiene la via di segnalazione Hedgehog e altri percorsi dipendenti dalle ciglia che coordinano il patterning embrionale e l’omeostasi tissutale. L’alterazione di RPGRIP1L compromette la ciliogenesi e la trasduzione del segnale, collegando cambiamenti nel “gating” ciliare a fenotipi di sviluppo pleiotropici. Le varianti genetiche di RPGRIP1L sono state associate a ciliopatie, incluse le sindromi dello spettro di Joubert e di Meckel, rendendolo un nodo utile per studiare nei sistemi cellulari umani i meccanismi patologici guidati dalle ciglia.

RPGRIP1L Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RPGRIP1L senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RPGRIP1L Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RPGRIP1L nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RPGRIP1L, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RPGRIP1L. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RPGRIP1L nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RPGRIP1L nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RPGRIP1L nelle cellule tumorali con espressione di RPGRIP1L silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.