Rock-2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400468-ACT

ROCK2 (Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 2) codifica a Rock-2, uma quinase de serina/treonina que atua como o principal efetor de RhoA na regulação da contratilidade actina–miosina. A Rock-2 fosforila substratos como a cadeia leve de miosina e as quinases LIM para controlar a formação de fibras de estresse, a dinâmica de adesões focais, a polaridade celular e a citocinese, moldando assim a migração celular e a arquitetura tecidual. Por meio desses efeitos sobre o citoesqueleto, a ROCK2 integra sinais em vias relacionadas à mecanotransdução, à remodelação da matriz extracelular e ao tônus endotelial e do músculo liso. A desregulação da sinalização de ROCK2 tem sido associada a alterações do comportamento invasivo, disfunção vascular, respostas inflamatórias e processos ligados à fibrose, tornando-a um alvo amplamente utilizado para dissecar fenótipos de doença impulsionados pelo citoesqueleto.

Rock-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ROCK2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Rock-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ROCK2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ROCK2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Rock-2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ROCK2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Rock-2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Rock-2 em células tumorais com expressão de ROCK2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.