robo4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401856-ACT

ROBO4 (recetor de orientação roundabout 4) codifica um recetor transmembranar enriquecido em células endoteliais que ajuda a manter a estabilidade vascular e regula o comportamento angiogénico. O Robo4 modula a dinâmica do citoesqueleto e a função de barreira endotelial ao influenciar a sinalização de orientação e adesão, incluindo a comunicação cruzada com sinais SLIT e vias associadas à permeabilidade induzida por VEGF. Por estes mecanismos, o ROBO4 é amplamente relevante para processos como a brotação de novos vasos, a inflamação vascular e o tráfego de leucócitos na microvasculatura. A expressão ou sinalização desregulada de ROBO4 tem sido associada a angiogénese patológica e a alterações da integridade vascular observadas numa variedade de fenótipos vasculares cardiovasculares e associados a tumores.

robo4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ROBO4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

robo4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ROBO4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ROBO4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de robo4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ROBO4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de robo4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via robo4 em células tumorais com expressão de ROBO4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.