robo2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-435289-ACT

O gene Robo2 de camundongo codifica o recetor de orientação axonal Roundabout robo2, uma proteína transmembranar que se liga a ligandos Slit para regular a orientação de axónios, a migração neuronal e o crescimento de neurites durante o desenvolvimento do sistema nervoso. A sinalização mediada por Robo2 influencia a dinâmica do citoesqueleto e a motilidade celular por meio de vias de GTPases da família Rho, apoiando o padrão espacial e a conectividade no SNC e no SNP. Para além do neurodesenvolvimento, o Robo2 está implicado na morfogénese epitelial e na organogénese, com estudos genéticos e de expressão a relacionarem alterações na atividade de ROBO2 com anomalias congénitas e fenótipos do neurodesenvolvimento. Estas funções tornam o Robo2 um alvo relevante para dissecar a sinalização por pistas de orientação, a montagem de circuitos e os mecanismos de desenvolvimento em modelos murinos.

robo2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Robo2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

robo2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Robo2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Robo2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de robo2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Robo2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de robo2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via robo2 em células tumorais com expressão de Robo2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.