RNF43 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403797-ACT

RNF43 codifica uma ligase E3 de ubiquitina do tipo RING que atua como reguladora negativa da sinalização Wnt/β-catenina ao promover a ubiquitinação e a degradação dos receptores Frizzled, limitando assim a abundância de receptores Wnt na membrana plasmática. Por meio dessa função, RNF43 ajuda a controlar a homeostase epitelial, a sinalização de células-tronco e programas de proliferação sensíveis à amplitude da via Wnt. Alterações na atividade de RNF43 têm sido associadas à desregulação da sinalização Wnt e a contextos genômicos relacionados à biologia tumoral gastrointestinal e pancreática, tornando-o relevante para estudos de dependência de via e de retroalimentação de sinalização. RNF43 também é utilizado como ponto de partida molecular para investigar a regulação do tráfego de receptores mediada por ubiquitina e o crosstalk entre vias.

RNF43 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RNF43 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RNF43 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RNF43 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RNF43, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RNF43. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RNF43 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RNF43 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RNF43 em células tumorais com expressão de RNF43 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.