RNase L Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403412-ACT

O RNASEL humano codifica a RNase L, uma endorribonuclease induzível por interferão que é ativada por oligoadenilatos 2′-5′ gerados por proteínas OAS durante o reconhecimento imunitário inato. Uma vez ativada, a RNase L cliva RNA celular e viral para limitar a replicação, remodelar o transcriptoma e amplificar a sinalização antiviral através de produtos de degradação de RNA que estimulam vias de reconhecimento de padrões. Esta atividade cruza-se com programas de interferão/JAK-STAT, biologia de grânulos de stress, controlo da tradução e apoptose, ligando a RNase L à regulação da inflamação e a decisões sobre o destino celular. Alterações genéticas e funcionais em RNASEL têm sido investigadas no contexto da biologia das infeções e de mecanismos de doenças associadas ao sistema imunitário, bem como de fenótipos associados a tumores relacionados com a desregulação da homeostase do RNA.

RNase L O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RNASEL sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RNase L O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RNASEL em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RNASEL, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RNase L. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RNASEL nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RNase L no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RNase L em células tumorais com expressão de RNASEL silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.