RNase H1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402850-ACT

O RNASEH1 humano codifica a RNase H1, uma endonuclease nuclear e mitocondrial que degrada especificamente a cadeia de RNA de híbridos RNA:DNA, auxiliando na remoção de R-loops durante a transcrição e a replicação. Ao processar primers de RNA e resolver intermediários híbridos, a RNase H1 contribui para a estabilidade do genoma, para a replicação e o reparo do DNA mitocondrial e para a coordenação de conflitos entre replicação e transcrição. A desregulação do turnover de híbridos RNA:DNA tem sido associada ao estresse replicativo e à sinalização de dano ao DNA, tornando o RNASEH1 um ponto relevante para o estudo de vias que conectam o metabolismo de ácidos nucleicos às respostas celulares ao estresse. Alterações na função da RNase H1 também se associam a fenótipos de disfunção mitocondrial, permitindo a investigação mecanística da manutenção do genoma mitocondrial em contextos relevantes para doenças.

RNase H1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RNASEH1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RNase H1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RNASEH1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RNASEH1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RNase H1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RNASEH1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RNase H1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RNase H1 em células tumorais com expressão de RNASEH1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.