RIP3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401008-ACT

O RIPK3 humano codifica a proteína quinase 3 de serina/treonina de interação com receptor (RIP3), um mediador central da necrose programada (necroptose) e da morte celular inflamatória. A RIP3 integra sinais a montante provenientes de receptores de morte e de vias da imunidade inata para ativar a ruptura de membrana mediada por MLKL, ao mesmo tempo em que também se cruza com a sinalização de NF-κB, a comunicação com o inflamassoma e respostas ao estresse metabólico. A atividade desregulada de RIPK3 está associada a inflamação aberrante e mecanismos de lesão tecidual implicados em neurodegeneração, dano por isquemia-reperfusão, imunopatologia associada a infecções e biologia do câncer. Como nó de via, a RIP3 é frequentemente estudada para dissecar comutadores dependentes do contexto entre apoptose, necroptose e sinalização pró-sobrevivência.

RIP3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RIPK3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RIP3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RIPK3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RIPK3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RIP3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RIPK3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RIP3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RIP3 em células tumorais com expressão de RIPK3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.