RILP Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402680-ACT

RILP (proteína lisossomal interagente com Rab) é um efetor-chave de Rab7 que coordena o posicionamento, a maturação e o tráfego de carga de endossomos tardios e lisossomos ao longo dos microtúbulos. Ao conectar membranas positivas para Rab7 ao complexo motor dineína–dinactina e ao participar de eventos de fusão entre endossomos e lisossomos, a RILP influencia a redução de receptores, a degradação lisossomal e o fluxo autofágico. Essas funções colocam a RILP no centro da homeostase endolisossomal e de vias de tráfego de membranas que moldam a saída de sinalização e a proteostase. A desregulação do transporte dependente de Rab7–RILP tem sido associada a respostas de estresse celular e a fenótipos relevantes para neurodegeneração, biologia de infecções e adaptação de células cancerosas a alterações na função lisossomal.

RILP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RILP sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RILP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RILP em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RILP, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RILP. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RILP nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RILP no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RILP em células tumorais com expressão de RILP silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.