RIC-3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405366-ACT

O RIC3 humano codifica a RIC-3, uma chaperona residente do retículo endoplasmático que promove o dobramento, a montagem e o tráfego de canais iónicos regulados por ligando selecionados, mais notavelmente os recetores nicotínicos de acetilcolina. Ao controlar a maturação e a expressão dos recetores na superfície celular, a RIC-3 influencia a transmissão sináptica colinérgica, a excitabilidade neuronal e programas de sinalização a jusante dependentes de cálcio. A regulação alterada da biogénese dos recetores nicotínicos e da função das redes colinérgicas tem sido associada a fenótipos neurológicos e neuropsiquiátricos, tornando o RIC3 um ponto útil para estudar a proteostase dos recetores e a sinalização sináptica. A RIC-3 também é usada como uma ferramenta mecanística para dissecar o controlo de qualidade do RE, a estequiometria dos complexos de canais e alterações dependentes de estímulo na disponibilidade de recetores.

RIC-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RIC3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RIC-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RIC3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RIC3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RIC-3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RIC3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RIC-3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RIC-3 em células tumorais com expressão de RIC3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.