Ribophorin I Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402286-ACT

RPN1 codifica a riboforina I, um componente essencial do complexo oligosacariltransferase (OST) incorporado na membrana do retículo endoplasmático rugoso, que sustenta a glicosilação N-ligada co-traducional de proteínas secretórias e de membrana recém-sintetizadas. Ao coordenar a transferência de glicanos e a maturação proteica, a riboforina I contribui para a proteostase do RE, o controlo de qualidade e o tráfego ao longo da via secretória, com impactos a jusante na sinalização por recetores e na composição do proteoma da superfície celular. Alterações na capacidade de glicosilação do RE e a desregulação de subunidades do OST têm sido associadas a respostas de stress celular e a processamento proteico aberrante observados em múltiplos contextos relevantes para doenças, tornando o RPN1 um ponto útil para estudar a biogénese de glicoproteínas. A modulação experimental da expressão de RPN1 ajuda a investigar como a maquinaria de glicosilação residente no RE molda a eficiência de dobragem, a degradação via degradação associada ao RE (ERAD) e a estabilidade global do proteoma.

Ribophorin I O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RPN1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Ribophorin I O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RPN1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RPN1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Ribophorin I. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RPN1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Ribophorin I no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Ribophorin I em células tumorais com expressão de RPN1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.