RhoB Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400875-ACT

O RHOB humano codifica a RhoB, uma pequena GTPase prenilada da família Rho que atua como um regulador de resposta rápida da remodelação do citoesqueleto de actina, do tráfego endossomal e da renovação de receptores de membrana. A RhoB integra sinais de receptores de fatores de crescimento e de vias de estresse celular para modular a dinâmica de adesões focais, a forma celular e a motilidade por meio de efetores a jusante que interagem com programas associados a ROCK e a forminas. Ela também contribui para respostas transcricionais e de sobrevivência ao influenciar as saídas das vias MAPK e PI3K/AKT, conectando a sinalização próxima à membrana a decisões no núcleo. Alterações na expressão ou na regulação de RHOB têm sido associadas a fenótipos relacionados ao câncer, incluindo invasão, respostas ao estresse terapêutico e mudanças na suscetibilidade à apoptose, tornando-o relevante para estudos mecanísticos da plasticidade de células tumorais e da adaptação ao microambiente.

RhoB O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RHOB sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RhoB O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RHOB em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RHOB, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RhoB. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RHOB nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RhoB no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RhoB em células tumorais com expressão de RHOB silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.