RhoA Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-419194-ACT

Rhoa codifica a pequena GTPase RhoA, um regulador central da dinâmica do citoesqueleto de actina que controla a formação de fibras de estresse, a renovação de adesões focais e a contratilidade actomiosina. A RhoA alterna entre os estados ligados a GDP e a GTP para coordenar a sinalização por meio de efetores a jusante, como ROCK e mDia, integrando sinais de GPCRs, integrinas e receptores de fatores de crescimento. Em células de camundongo, vias dependentes de RhoA influenciam a migração celular, a citocinese, a mecanotransdução e a função de barreira epitelial, vinculando a atividade de Rhoa a processos relevantes para inflamação, fibrose, remodelamento vascular e invasão de células tumorais em modelos experimentais. A sinalização desregulada de RhoA perturba a polaridade celular e a arquitetura tecidual e é frequentemente investigada em estudos de morfogênese do desenvolvimento e de reprogramação do citoesqueleto associada ao câncer.

RhoA O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Rhoa sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RhoA O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Rhoa em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Rhoa, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RhoA. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Rhoa nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RhoA no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RhoA em células tumorais com expressão de Rhoa silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.