RGMc Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-406186-ACT

O HFE2 humano codifica a molécula de orientação repulsiva C (RGMc, também conhecida como hemojuvelina), uma proteína de membrana ancorada por glicosilfosfatidilinositol que atua como co-receptor no eixo de sinalização BMP/SMAD, o qual controla a transcrição hepática de hepcidina. Ao modular a sinalização dependente de BMP6 e a fosforilação subsequente de SMAD1/5/8, a RGMc integra sinais de detecção de ferro para manter a homeostase sistêmica do ferro por meio da regulação da exportação de ferro mediada pela ferroportina. A atividade alterada de HFE2/RGMc está associada à expressão desregulada de hepcidina e a fenótipos de sobrecarga de ferro, tornando-a um nó útil para dissecar redes do metabolismo do ferro. Em modelos baseados em células, a perturbação dos níveis de RGMc permite estudos mecanísticos da dinâmica da via BMP, dos circuitos regulatórios da hepcidina e de programas transcricionais relacionados ao manejo do ferro.

RGMc O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HFE2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RGMc O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HFE2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HFE2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RGMc. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HFE2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RGMc no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RGMc em células tumorais com expressão de HFE2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.