RFC1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402122-ACT

RFC1 codifica a subunidade 1 do fator de replicação C, a subunidade maior do complexo carregador de clamp RFC, que carrega a PCNA no DNA para promover a atividade de DNA polimerases de alta processividade. Esse processo dependente de ATP é central para a replicação do DNA, a maturação de fragmentos de Okazaki e múltiplas vias de reparo do DNA, incluindo reparo por excisão de nucleotídeos, reparo por excisão de bases e reparo de incompatibilidades (mismatch repair). Por meio de seu papel nas respostas ao estresse replicativo e na manutenção da estabilidade do genoma, RFC1 é frequentemente estudado em contextos de controle do ciclo celular e sinalização de dano ao DNA. A atividade desregulada da via de RFC1 é relevante para a biologia proliferativa e para fenótipos de instabilidade genômica, comumente modelados no câncer e em outros distúrbios associados ao reparo do DNA.

RFC1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RFC1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RFC1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RFC1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RFC1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RFC1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RFC1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RFC1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RFC1 em células tumorais com expressão de RFC1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.