RecQL4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403224-ACT

RECQL4 codifica a helicase humana de DNA RecQ, RecQL4, um fator de manutenção do genoma necessário para o início da replicação do DNA, a estabilização de forquilhas de replicação estagnadas e múltiplos mecanismos de reparo do DNA, incluindo recombinação homóloga e reparo por excisão de bases. A RecQL4 atua na rede mais ampla de resposta a danos no DNA para preservar a integridade cromossômica durante a fase S e após estresse genotóxico. A atividade desregulada de RECQL4 está associada a estresse de replicação, instabilidade cromossômica e sensibilidade alterada a agentes que danificam o DNA, tornando-a relevante para o estudo de vias de estabilidade do genoma. Variantes patogênicas em RECQL4 estão associadas a doenças hereditárias com defeitos de desenvolvimento e predisposição ao câncer, apoiando seu uso em modelos mecanísticos de disfunção de reparo do DNA associada a doenças.

RecQL4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RECQL4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RecQL4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RECQL4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RECQL4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RecQL4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RECQL4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RecQL4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RecQL4 em células tumorais com expressão de RECQL4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.