RBM35B Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-408008-ACT

O ESRP2 humano (RBM35B) codifica uma proteína reguladora de splicing epitelial que se liga ao pré‑mRNA e orienta programas de splicing alternativo que ajudam a manter a identidade epitelial e a arquitetura das junções célula–célula. Por meio da regulação de isoformas de splicing em vias que controlam a dinâmica do citoesqueleto, as junções aderentes e a transição epitélio–mesênquima (EMT), o ESRP2 contribui para um controle dependente do contexto da diferenciação, migração e do output de sinalização. Alterações na expressão do ESRP2 ou na sua atividade de splicing têm sido associadas a transcriptomas aberrantes relacionados à EMT e a um processamento de RNA desregulado observado em múltiplos modelos tumorais e de desenvolvimento. Como um nó que conecta a especificidade de ligação ao RNA à regulação gênica resolvida por isoformas, o ESRP2 é amplamente utilizado para estudar a mudança fenotípica dirigida por splicing e o redirecionamento de vias.

RBM35B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ESRP2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RBM35B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ESRP2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ESRP2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RBM35B. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ESRP2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RBM35B no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RBM35B em células tumorais com expressão de ESRP2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.