Rab 8A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404285-ACT

RAB8A codifica a pequena GTPase Rab8A, um regulador central do tráfego de membranas pós-Golgi que coordena a exocitose polarizada, o brotamento de vesículas e o ancoramento (tethering) durante a entrega de carga à membrana plasmática e ao cílio primário. A Rab8A atua em conjunto com GEFs e efetores para controlar a dinâmica de endossomos de reciclagem, a ciliogênese e a organização do citoesqueleto, influenciando assim a polaridade celular e a migração direcionada. Por meio dessas funções, RAB8A participa de vias associadas à biologia das ciliopatias e à sinalização do desenvolvimento, e sua desregulação tem sido relacionada a programas de secreção alterados e a comportamentos celulares invasivos em contextos ligados ao câncer. O tráfego dependente de Rab8A também se conecta ao transporte neuronal e à remodelação de membranas relacionada à autofagia, tornando-o relevante para estudos mecanísticos em diversos tecidos.

Rab 8A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RAB8A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Rab 8A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RAB8A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RAB8A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Rab 8A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RAB8A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Rab 8A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Rab 8A em células tumorais com expressão de RAB8A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.